کلونینگ و بیان فرم جهش یافته و غیرفعال توکسین بوردتلا پرتوسیس سویه بومی ایران

سابقه و هدف: سیاه سرفه بیماری حاد و مسری دستگاه تنفسی به ویژه در نوزادان و کودکان و یکی از ده عامل عمده مرگ ناشی از بیماری های عفونی است. علیرغم کاهش ابتلا به دلیل واکسیناسیون با باکتری کشته شده عامل بیماریزا (Bordetella pertussis)، افزایش بیماری در دهه اخیر بیانگر باز پدیدی ناشی از تنوع ژنتیکی باکتری و ناکارمدی واکسن های کنونی است. بنابراین طراحی واکسنهای جدید و موثر بر پایه سویه های شایع هر جمعیت امری ضروری است. در این مطالعه پروتئین نوترکیب عیر فعال مهمترین آنتی ژن باکتریایی (توکسین پرتوسیس،PTX) سویه شایع بیماریزا در ایران بر پایه نسل جدید واکسنهای غیر سلولی تولید شد. مواد و روش­ها: سویه باکتری مورد استفاده در این مطالعه جهت استخراج ژنوم و تکثیر ژن، از بین سویه های بیماریزای جدا شده از بیماران ایرانی از آزمایشگاه مرجع سیاه سرفه بخش میکروب شناسی انستیتو پاستور ایران انتخاب شده است. پس از کشت باکتری و استخراج DNA ژنومیک، قطعه ptx-s1 (ناحیه فعال آنزیمیPTX) تکثیر و در 18pUC کلون و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، جهش زایی هدفمند آرژنین 9 به لیزین و گلوتامیک اسید 129 به گلیسین انجام و با تعیین توالی ارزیابی شد. قطعه جهش یافته در سیستم –E.coli BL21 pET15b و جایگاههای  BamHΙ/NdeIبا 5/0 mM IPTG القا و بیان شد. سپس توسطSDS-PAGE  و ایمونوبلات ارزیابی شد. خالص سازی با کروماتوگرافی تمایلی انجام و غلظت پروتئین مشخص شد.. یافته­ها: جهش های Glu129Lys, Arg9Gly با تعیین توالی تایید شد. وجود باند28kDa در ژل و ایمونوبلات با استفاده از آنتی بادیAnti-His  بیان پروتئین تایید کرد. پروتئین به مقدارmg/ml 0/36 خالص سازی شد. نتیجه گیری: بر اساس نتایج این مطالعه فرم غیر فعال و ایمونوژن PTX سویه غالب بیماریزا در ایران می تواند به تنهایی و یا در ترکیبی با سایر آنتی ژنها جهت طراحی واکسن های بدون سلولی مورد استفاده قرارگیرد نتی